In minder dan tien jaar tijd is metabolomics, de nieuwste loot aan de 'omics'-boom, uitgegroeid tot hot topic in de life sciences. In 1998 werd de term bedacht, in 2006 waren er al meer dan 500 publicaties over het onderwerp. Metabolomics onderzoekt de kleine moleculen die een organisme produceert, de metabolieten. Dat zijn tientallen klassen van verbindingen zoals suikers, aminozuren of geur- en smaakstoffen. 'We proberen zoveel mogelijk moleculen uit deze groep tegelijk in een analyse te meten,' zegt Dr. Robert Hall, metabolomicsspecialist en manager van de Bioscience groep bij Plant Research International (PRI) in Wageningen. 'Vroeger had je een heel gericht systeem, bijvoorbeeld een analyse alleen voor aminozuren. Met metabolomics wil je je niet beperken tot een bepaalde groep componenten. Bijvoorbeeld omdat je vooraf niet weet welke groep het meest interessant is.' Metabolieten zijn de producten van enzymen (eiwitten), die op hun beurt weer gemaakt zijn doordat genen voor ze coderen. Een verandering in een gen kan zorgen voor een verandering in metabolieten. Verschillen in genen kun je dus opsporen door te kijken naar de metabolieten in een cel.

Kwaliteitscontrole
GC-MS is een veel gebruikte analysetechniek voor dit onderzoek, samen met LC-MS. De eerste is vooral geschikt om kleine metabolieten te analyseren zoals aminozuren, suikers en organische zuren in cellen, weefsel of bloedprodukten. LC-MS wordt toegepast om componenten zoals nucleotiden, geur- en smaakstoffen te analyseren. Promovenda Maud Koek ontwikkelt GC-MS technieken voor metabolomics. Daarover publiceerde zij vorig jaar een succesvol artikel in het tijdschrift Analytical Chemistry. Dat haalde de top-10 van ACS publicaties die in het jaar van uitgave het meest geciteerd zijn. Koek werkt bij TNO Quality of Life in Zeist aan haar onderzoek. 'De insteek is: hoe optimaliseer je een analyse voor zoveel mogelijk verschillende metabolieten, hoe valideer je dat en hoe ga je je kwaliteitscontrole doen?'
'Ik ben best trots op het resultaat,' zegt de onderzoekster. 'Het is een van de weinige publicaties op metabolomics gebied waarin de prestaties van de analysemethode uitgebreid worden beschreven. Vaak kijkt men minder grondig naar de kwaliteit van de methode en stapt snel over naar de applicatie.' De robuustheid en betrouwbaarheid van de methode is belangrijk, zegt Koek, omdat je anders nooit weet wat je meet. 'De verschillen in metabolietconcentraties kunnen heel klein zijn, bijvoorbeeld van voedingsgerelateerde metabolieten in bloed van mensen die gezond of minder gezond eten. Dat betekent dat je analyse heel precies moet zijn om die verschillen nog significant te kunnen meten.'
Koek onderzocht drie verschillende micro-organismen. Monsters daarvan bevatten zo'n zeshonderd metabolieten. Ze analyseerde deze op een standaard GC-MS apparaat. Door het toevoegen van kwaliteitsstandaarden hield ze het systeem in de gaten. 'Als je een afwijking ziet bij de meting van je standaardcomponent weet je dat er iets mis is in je systeem. Dat kun je corrigeren door een liner te verwisselen of een vervuild stukje van de kolom af te halen,' legt Koek uit.
De promovenda deelde vervolgens alle gemeten stoffen in drie groepen in. 'Organische zuren en suikers kun je bijvoorbeeld heel nauwkeurig meten. Bij amiden moet je de kwaliteit goed in de gaten houden. Als de toestand van je systeem achteruit gaat zullen dat de eerste componenten zijn waarbij je effecten ziet. Dan kun je ingrijpen.'

Databerg
Het onderzoeksinstituut PRI richt zich op het verbeteren van planten door te kruisen. Het selecteren van de juiste genen daarvoor is mogelijk door te kijken naar de metabolieten van de plant. Planten maken veel meer metabolieten dan micro-organismen of dierlijke cellen. Er zijn naar schatting tweehonderdduizend metabolieten in het plantenrijk, een monster van een plant bevat er vaak duizenden. 'Niemand weet waarom,' zegt Robert Hall, 'maar men denkt dat het is omdat planten niet weg kunnen rennen. Het is een natuurlijk verdedigingsmechanisme van de plant. Onze uitdaging is dus om een heel rijk mengsel aan metabolieten in één analyse te kunnen meten.'
'Je wil eigenlijk zoveel mogelijk componenten identificeren en kwantificeren,' zegt Hall, 'Maar wij beginnen met detecteren.' Dat confronteert de onderzoekers meteen met het belangrijkste probleem binnen metabolomics. De apparatuur produceert een grote hoeveelheid data. 'Hoe je omgaat met die data is een enorme uitdaging,' zegt Hall. 'Hoe kan je met slimme software conclusies trekken? Als je zoekt naar een link tussen een aantal pieken en een bepaalde fenotypische eigenschap dan zal je altijd iets vinden dat gekoppeld lijkt te zijn. Of dat biologisch relevant is kun je alleen met biostatistiek testen.'
Niet alleen het aantal componenten per monster, maar ook het aantal samples is een probleem. Hall: 'We willen honderden samples meten. Er zit een enorm tijdsverschil tussen de eerste en de laatste. Het apparaat verandert in die tijd, er zijn kleine temperatuurverschillen. Pieken gaan licht verschuiven waardoor je de spectra niet direct met elkaar kunt vergelijken. Er is software voor nodig om meerdere spectra netjes uit te lijnen.'
Wanneer alle honderden spectra zijn uitgelijnd kun je er statistiek op loslaten. Er zijn diverse mogelijkheden zoals clusteranalyse en principal components analyse (PCA). De meeste methoden zoeken verschillen of overeenkomsten tussen spectra. 'Met PCA kun je uit twee spectra met 6000 pieken de verschillen in één of twee pieken laten zoeken. Je kan daarmee dus zeggen welke samples het meest op elkaar lijken en welke het meest van elkaar verschillen. Daarna kun je ook bepalen om welke metabolieten het gaat. Vanuit het totaal kun je dus terug naar individuele metabolieten,' legt Hall uit.
Het automatiseren van het uitlijnen en analyseren van honderden spectra is pas sinds kort mogelijk. 'Vroeger kon je alleen met de hand de componenten uit de data halen. De combinatie van hardware en software is veel beter geworden,' zegt Hall. 'Door de komst van omics-technologiën met name in de bioinformatica kunnen we aan datamining doen zonder vooraf te weten waar we naar kijken.'

Supersnel
Naast betere software is er ook behoefte aan betere scheiding en gevoeligheid van de meetmethodes. Maud Koek werkt aan een nieuwe techniek, GCxGC-MS. Daarbij wordt het monster gescheiden op twee gekoppelde kolommen met verschillende eigenschappen. 'Wij scheiden eerst op polariteit en vervolgens op kookpunt,' legt Koek uit. 'Je krijgt dus een extra scheidend vermogen. Nadeel is dat de dataverwerking een stuk lastiger is. Je hakt de pieken in de tweede dimensie in stukken waardoor de dataanalyse veel complexer is. Bij TNO werken we aan verbetering van de datapreprocessing en data-analyse.'
Bij PRI zouden ze ook graag sneller willen meten, bijvoorbeeld om monsters in tienvoud te analyseren in plaats van in duplo. De statistiek werkt dan beter. Een nieuwe analysemethode die dat kan is Direct Flow Injection. Daarbij wordt het monster direct op de MS-detector geïnjecteerd en is er dus helemaal geen scheiding. Hall zegt: 'Niet iedereen gelooft erin omdat je allerlei adducten krijgt. Maar er zijn trucs voor om die pieken uit elkaar te halen. Een meting duurt bij ons nu ongeveer een uur. Met Direct Flow Injection kun je in dertig seconden screenen. Dat zou fantastisch zijn.'

Het volledige artikel is gepubliceerd in Chemisch2Weekblad no. 17, 15 september 2007.