De beste methode om een biomolecuul dat je wilt onderzoeken uit de complexe vijver van biologisch materiaal te vissen is om er een label of handvat aan te plakken zodat je hem in de analyses kunt herkennen. Maar hoe plak je een label selectief aan een biomolecuul? Enter synthetisch organisch chemici. Zij zijn in staat van tevoren een functionele groep, de zogeheten chemical reporter, covalent te binden aan bijvoorbeeld een suiker of aminozuur. Deze cellulaire bouwsteen voeden aan een cel leidt vervolgens tot metabole inbouw. Daarna laat je de functionele groep selectief reageren met een handvat ofwel probe om hem uit het biologische mengsel te vissen, zoals een harsbolletje of fluorescente marker. Zo kun je precies nagaan wat er tijdens het metabolisme van de cel is gebeurd met de chemical reporter.
Zeldzaam
De reactie tussen de chemical reporter en de probe is essentiëel. Deze bioorthogonale reacties moeten aan strenge eisen voldoen: de reactieve groepen mogen niet voorkomen in de natuur en worden in een biologisch systeem dan ook met rust gelaten. Komen de twee reactieve groepen bij elkaar in de buurt dan reageren ze snel en selectief met elkaar. De uitgangsstoffen en reactieproducten zijn niet toxisch en kunnen dus in theorie in een levend systeem worden toegepast.
Er zijn maar een paar reacties bekend die aan deze eisen voldoen. De beste tot nu toe is de reactie tussen een azide en een cyclooctyn. Daarbij wordt in een cycloadditiereactie een 1,4-gesubstitueerd triazool gevormd. De reactie is afgeleid van wat vaak de 'clickreactie' wordt genoemd naar de chemie die Barry Sharpless begin deze eeuw ontwikkelde. Daarbij reageert een azide met een klein, eindstandig alkyn met behulp van een koperkatalysator. De reactie is efficiënt, maar door de aanwezigheid van Cu(I) niet bioorthogonaal. 'Koper is toxisch dus voor levende cellen kun je deze reactie niet gebruiken. 'Ook in bijvoorbeeld coatings is koper uit den boze. In deze gevallen is de reactie met cyclooctyn wel toepasbaar. Wij richten ons daarom op deze reactie,' legt de Nijmeegse syntheticus Floris Van Delft uit. Hij werkt aan het verbeteren en, in samenwerking met biologen, toepassen van bioorthogonale chemie.
In sommige gevallen is de kopergekatalyseerde reactie een betere keus, zegt de Amsterdamse organisch syntheticus Jan van Maarseveen. 'Cyclooctyn is een enorm vet molecuul. Als we dat inbouwen in kleine peptiden waarmee we de natuur willen nabootsen is dat veel te dominant aanwezig. Het beïnvloedt de eigenschappen te veel. In dat geval gebruiken we een klein lineair alkyn en hebben we koper nodig om de reactie te laten verlopen.'
Nieuwe kampioenen
Voor synthetici ligt de uitdaging in het ontwerpen van de reactanten. 'Als je die eenmaal hebt kan een kind de reactie doen,' zegt Van Maarseveen. 'Maar de synthese van een cyclooctyn vergt vele stappen. We hebben hier wel eens een bioloog gehad die de synthese wilde doen maar dat liep spaak. Die technieken moet je van jongs af aan in de vingers hebben.'
Floris van Delft en zijn collega's ontwikkelden het snelst reagerende systeem tot nu toe, vertelt hij. 'De koningin van de bioorthogonale chemie, Carolyn Bertozzi, maakte in 2007 al een difluoro-cyclooctyn. Die werkte redelijk goed maar de synthese was een ramp. Geert-Jan Boons waar ik mijn sabbatical doorbracht (Complex Carbohydrate Research Center, GA, USA) had een cyclooctyn met twee fenylringen eraan. Zo zit er nog meer stress in de drievoudige binding zodat die nog reactiever is. Terug in Nederland voegden wij nog een stikstof toe in de ring zodat we een aza-dibenzocyclooctyn hebben. In een negenstaps synthese krijgen we 41% opbrengst. Dit DIBAC geeft met azide de snelste reactie tot nu toe.' Van Delft, van Hest en collega's publiceerden deze recordhouder wel maar vroegen er geen patent op aan. Het Amerikaanse bedrijfje Click Chemistry Tools was er vervolgens snel bij. 'Hun cyclooctyn-portfolio bestaat momenteel voor zo'n tachtig procent uit afgeleiden van onze verbindingen.'
Van Delft zit er niet mee. Hij is alweer met het volgende synthetische huzarenstukje bezig. 'We zoeken naar de balans tussen stabiliteit in de biologische omgeving en reactiviteit naar de azide. Verder is van belang dat we de wateroplosbaarheid nog verder verbeteren. Dat kan door de apolaire fenylgroepen weer weg te laten.' Een patentaanvraag is onlangs ingediend voor een verbinding die bijna net zo snel reageert als DIBAC, veel eenvoudiger te synthetiseren en bovendien beter wateroplosbaar is.
Vissen naar eiwitten
De andere kant van de reactie, het azide, is synthetisch gezien eenvoudiger. Dit is de groep die aan het biomolecuul wordt vastgemaakt als toekomstig handvat ofwel chemical reporter. Idealiter blijft de groep intact als het biomolecuul de hele biologische machinerie doormaakt. Van Delft maakte een azido-groep vast aan de monosaccharide mannosamine dat een rol speelt in de glycosylering in een cel. De azido-suiker komt na expressie terecht in een glycoproteine in de celwand waar hij met behulp van een cyclooctyn kan worden gedetecteerd. Samen met medici gebruikt Van Delft de gelabelde suiker om defecten in de glycosylering op te sporen bij patienten met een genetische afwijking in de glycosylering.
Promovenda Merel Nessen gebruikte onder begeleiding van Jan van Maarseveen en bioloog Luitzen de Jong een soortgelijke methode om te onderzoeken wat er gebeurt als je een E. Coli-bacterie onder stress brengt door alle zuurstof weg te halen. 'Tegelijk met het weghalen van de zuurstof voegen we een azidehoudend aminozuur bij de cellen. Na een paar minuten maken we de cellen dood en hakken we alle eiwitten die gevormd zijn in stukken met een protease. Dan voegen we harsbolletjes toe met cyclooctyn eraan en filtreren. Alle eiwitten waar het azidehoudend aminozuur is ingebouwd vissen we zo uit de oplossing. Dan kunnen we nagaan welke eiwitten er meer of juist minder worden gevormd onder stress.'
Alternatieven
De azide-cyclooctyn cycloadditie is de beste bioorthogonale chemie tot nu toe, vinden Van Maarseveen en van Delft. De koperhoudende variant is ook zeer bruikbaar maar heeft zijn beperkingen wat betreft toxiciteit en nevenreacties. Daarnaast zijn er nog enkele andere mogelijkheden. De Staudinger-reactie tussen een azide en een fosfine is selectief maar langzaam. Bovendien is een fosfine is door zijn gevoeligheid voor oxidatie lastig te hanteren. Floris van Delft onderzoekt of nitronen goede vervangers kunnen zijn voor azides. 'Azides zijn inert, klein en makkelijk in biomoleculen te bouwen. Maar wij willen een alternatief ontwikkelen om flexibeler zijn. Stel dat bijvoorbeeld een eiwit twee keer modificeren met verschillende probes. Dan kun je geen twee azides gebruiken.' De onderzoekers bouwden nitronen in suikers en in eiwitten en publiceerden hun vindingen in het tijdschrift Angewandte Chemie. Dat riep het artikel uit tot toppublicatie in een belangrijk nieuw onderzoeksgebied. De reactie tussen nitronen en cyclooctyn bleek nog sneller te verlopen dan met azides. Vooral de experimenten met het labelen van eiwitten waren succesvol. Het eiwit interleukine-8, dat een rol speelt bij darmontstekingen, kon op deze manier gelabeled worden zodat nieuwe diagnostiek in het verschiet ligt.
Click Chemistry Tools
De snelste acetyleen-reagens tot nu toe is ontdekt door Floris van Delft: aza-dibenzocyclooctyn ofwel DIBAC. Van Delft, van Hest en hun promovenda Marjoke Debets publiceerden de structuur en de synthesemethode begin 2010, maar de onderzoekers vroegen geen patent aan. Het gevolg is dat een bedrijf in de VS, Click Chemistry Tools, een groot deel van zijn producten op deze verbinding heeft gebaseerd. 25 mg van de eenvoudigste variant kost 115 dollar. Het bedrijfje levert ook de azide-partners.
Fatal attraction
Floris van Delft uit Nijmegen, in samenwerking met Boons, ontwikkelde een nieuwe bioorthogonale reactie tussen een nitron gebonden aan een eiwit en aza-dibenzocyclooctyn. van Delft: 'De reactie is een soort van explosie, het is een exotherme reactie. De reactanten hebben een 'fatal attraction' op elkaar. De moleculen zijn relatief onzichtbaar en kunnen zich vrij verplaatsen door het gastorganisme, net zoals twee onopvallende mensen zich vrij kunnen verplaatsen door de stad. Maar als ze bij elkaar in de buurt komen is het 'pats'!' (Van Delft et al, Angewandte Chemie (2010), DOI:10.1002/anie.201000408)
Dit artikel is gepubliceerd in C2W in 2010.
