Capillaire electroforese is een scheidingstechniek met veel mogelijkheden, denkt Govert Somsen, UHD Biomedische Analyse aan de Universiteit Utrecht. Maar nog geen heel bekende techniek. 'Ik heb nog heel wat missiewerk te verrichten,' zegt de onderzoeker. Zonder het te weten gebruiken honderden analisten dagelijks capillaire electroforese. Een DNA sequencer is namelijk gebaseerd op deze techniek waarmee DNA-moleculen op grootte worden gescheiden. Het principe van electroforese bestaat al een eeuw. 'Je maakt gebruik van de snelheid waarmee een ion in een oplossing beweegt als je er een hoogspanning over zet,' legt Somsen uit. 'Je bent niet afhankelijk van een extra fase zoals bij chromatografie. Het is daarom een hele simpele en elegante techniek.'
Capillaire electroforese (CE) is een verzamelnaam voor een groot aantal scheidingsmethoden. Capillaire Zone Electroforese is 'gewone' CE. Daarbij zit het monster in een waterige buffer. Het geheel stroomt door een capillair onder invloed van hoogspanning. Negatief geladen ionen stromen naar de positieve pool en andersom. Hun snelheid hangt af van de verhouding tussen de lading en de massa van de verbinding. Alle andere zogeheten CE-modes zijn varianten hierop. De verschillen zitten in de vloeistof. Dat kan een buffer zijn, een organisch oplosmiddel of een oplossing van polymeer. Er kunnen surfactanten aan zijn toegevoegd om ook neutrale stoffen te scheiden. Met cyclodextrines in de buffer kunnen ook chirale moleculen worden gescheiden. De binnenkant van het capillair kan een speciaal laagje (coating) krijgen. 'Het aardige vind ik,' zegt Somsen, 'dat het verschil alleen zit in die paar microliter vloeistof. Die kun je snel, makkelijk en goedkoop veranderen. Dat is anders dan bijvoorbeeld bij HPLC en GC waarbij je dan de hele kolom moet vervangen.'

Concurrentie
De vergelijking tussen CE en HPLC ligt voor de hand. Beide technieken zijn goed in het scheiden van moleculen in oplossing. 'CE is een fantastische complementaire techniek op HPLC,' vindt Robert Bastiaansen, CE specialist bij Beckman Coulter. 'In het begin is wel eens gezegd dat CE de vloeistofchromatografie zou gaan vervangen. Maar dat gaat niet gebeuren denk ik.' Joop Waterval is het met hem eens. Hij is groepsleider in een biotechlab bij Organon. Bij de analyses van geneesmiddelen in ontwikkeling gebruikt hij veelal HPLC om onzuiverheden op te sporen. Om er zeker van te zijn dat niets over het hoofd wordt gezien gebruiken de analisten CE ter controle. 'We hebben twee standaard CE apparaten staan. Die hebben een toegevoegde waarde omdat CE en HPLC een verschillend scheidingsprincipe hebben. Het is inderdaad wel eens voorgekomen dat we in een vroeg stadium van het ontwikkelen van een chromatografische methode met CE een onzuiverheid ontdekten die we met het concept van de LC-methode niet zagen.' Aanpassing van de LC-methode is meestal de volgende stap.
Geladen, complexe, wateroplosbare biomoleculen zoals EPO laten zich niet makkelijk scheiden. Met CE lukt dat wel. EPO is een zeer complex glycoproteïne (een eiwit met suikergroepen) dat uit tientallen vormen, zogenaamde glycovormen, bestaat. Het is een geneesmiddel dat de aanmaak van rode bloedcellen bevordert en wordt zoals bekend ook als doping gebruikt. Het geneesmiddel EPO moet echter voortdurend gekarakteriseerd worden. Met CE gekoppeld aan een hoge-resolutie massaspectrometer is het mogelijk alle glycovormen te scheiden en te identificeren.
Beide technieken hebben hun voor- en nadelen. CE is bijvoorbeeld heel goed in chirale scheidingen, zeggen alle drie de experts. Scheiding van enantiomeren is met name belangrijk voor de geneesmiddelindustrie, denk aan de Softenon-affaire. Ook grote, geladen biomoleculen zijn beter te scheiden met CE dan met vloeistofchromatografie, zegt Waterval. Maar de techniek is nog niet genoeg uitontwikkeld om HPLC te vervangen, vindt hij. 'De gevoeligheid moet met een factor tien omhoog en de precisie moet beter. Een goede reproduceerbare injectiekraan zou mooi zijn. Die zorgt ervoor dat het monster op de kolom wordt gebracht door een beetje druk aan te leggen. Maar als die druk niet altijd gelijk is, is je injectie en dus de scheiding niet reproduceerbaar. Verder verstoren andere componenten zoals zouten de scheiding nog te veel,' tempert Waterval het enthousiasme. 'Het hangt ervan af wie je het vraagt. Wij willen een heel klein verschil in concentratie meten. Ik kan me voorstellen dat researchlabs tevreden zijn met een semi-kwantitatief getal.'
'In het begin dacht men dat capillaire electroforese (CE) geweldig zou zijn voor het scheiden van eiwitten,' zegt Somsen. 'Dat viel heel erg tegen en daarom werken wij er nu nog aan.' De oorzaak van die tegenvaller zijn de silica-wanden van het capillair. Door het water (uit de buffer) zitten daar silanol-groepen aan het oppervlak. Eiwitten hebben sterk de neiging aan deze groepen te plakken en konden soms helemaal niet gescheiden worden.
Somsen en zijn collega's hebben een elegante methode ontwikkeld om de interactie van eiwitten met de capillairwand weg te nemen. Spoelen van de kolom met oplossingen van geladen polymeren, zoals polybreen, is voldoende om alle silanolgroepen te bedekken met een coating. 'We kunnen hiermee veel beter eiwitten scheiden dan vroeger. Verder zijn de uitkomsten ook veel beter reproduceerbaar,' zegt Somsen.

Massa
Koppeling van CE aan MS is de toekomst, denkt Somsen. 'De belangrijkste reden is het verkrijgen van informatie. Met MS kun je de componenten karakteriseren en als het meezit identificeren.' Somsen werkt sinds kort aan de toepassing van CE-MS voor metabolomics. 'Ik ben ervan overtuigd dat de kleine, polaire, geladen, vervelende verbindingen in metabolomics perfect kunnen worden gescheiden met CE. De koppeling met MS is daar pure noodzaak omdat je complexe mengsels met honderden verbindingen hebt. Daar moeten accurate massa's van worden gemeten.'
Het mooiste zou zijn als de makers van CE-apparatuur een compleet CE-MS systeem zouden leveren, zegt ook Waterval van Organon. 'Er is nu wel een interface beschikbaar die je tussen een bestaande CE en MS in kunt gebruiken maar dat is suboptimaal qua gevoeligheid. Wij willen ook niet zelf het optimale interface-systeem in elkaar hoeven knutselen.' Beckman Coulter begint daar nog niet aan, zegt Bastiaansen. 'Je kunt alles aan onze CE-apparatuur hangen wat je wilt, als je maar een electrospray-ionisatie hebt. Maar wij zijn geen MS-specialisten dus dan zouden we achter de feiten aan lopen. Dat moeten we niet doen.'
CE voor eiwitscheidingen is op dit moment de meest gebruikte toepassing, naast DNA sequencing, denkt Bastiaansen. 'Het ziet ernaar uit dat een complete kit de gouden standaard wordt,' zegt hij. 'De farmaceutische industrie wil niet telkens opnieuw het wiel uitvinden. Zij vragen om een totaaloplossing. Wij leveren bijvoorbeeld een kit voor het meten van monoklonale antistoffen. Daarin zit een capillair in, buffer, een testsample, alles volgens de standaarden. Ze hoeven het alleen nog maar te valideren.'
De lab-on-a-chip is een minder bekende toepassing van CE. Op een chip wordt met CE-principes gemanipuleerd. De kanaaltjes werken als capillairen en scheidingen zijn vaak op electroforese gebaseerd. Govert Somsen van de Universiteit Utrecht vindt het een mooie ontwikkeling: 'Het mooie is dat je de kanaalstructuur kan bouwen die je wil. Het biedt heel veel mogelijkheden.'
Onlangs publiceerden Amerikaanse onderzoekers nieuwe uitvinding, de zogenaamde tegenstroom-CE die bedoeld is voor toepassing op zo'n chip. Het monster wordt in z'n geheel op een chip gebracht en onder spanning gezet. De componenten willen naar het ene uiteinde maar er wordt een tegenstroom aangelegd die langzaam minder wordt. De snelste komen daardoor het eerst bij het einde. Naarmate de tegenstroom minder wordt komt ook de rest. Het resultaat is een trapsgewijze scheiding. 'Het principe is niet nieuw maar wel elegant,' zegt Somsen. 'Op slinkse wijze kun je een heel klein verschil in lading-massa verhouding heel lang gebruiken voor de scheiding. Je kan met een dergelijke methode zelfs isotopen van chloride scheiden.'

Behoudend
De farmaceutische industrie is behoudend wat betreft vervanging van analytische methodes, bevestigt Waterval van Organon. 'Er is heel veel kennis en ervaring aanwezig op het gebied van LC. Met een nieuwe techniek loop je eerst tegen nieuwe problemen aan. Het vergt veel investeringen. In een organisatie waar deadlines een rol spelen gaan we toch liever voor de techniek die het meest uitontwikkeld is en die het snelst een accuraat getal oplevert.'
Je moet inderdaad een aantal zaken netjes regelen om goede resultaten te krijgen, zegt Somsen. 'Je moet zorgen voor zuivere buffers, goed spoelen, het capillair netjes aanbrengen. Dat is een kwestie van mensen goed opleiden.' Bastiaansen vindt dat de techniek volwassen is geworden. Hij zegt: 'Mensen in de klinische labs hebben geen tijd meer om zich te verdiepen in de techniek. Toch halen ze goede resultaten met de kits. De techniek is dus heel robuust geworden.'

Het volledige artikel is gepubliceerd in Chemisch2Weekblad no. 20, 27 oktober 2007.