'Als er één techniek is die de structuurbiologie zo ver gebracht heeft is het wel röntgendiffractie met synchrotronstraling,' vindt Piet Gros, kristallograaf aan de Universiteit Utrecht. Bauke Dijkstra, onderzoeksdirecteur Life Sciences bij de Europese synchrotronfaciliteit ESRF en emeritus hoogleraar aan de Rijksuniversiteit Groningen is het roerend met hem eens. Röntgendiffractie is de enige manier om structurele data te verzamelen van grote biomoleculen zoals macromoleculaire eiwitcomplexen, zegt hij. 'Met NMR kun je niet naar dit soort grote moleculen kijken. Met elektronenmicroscopie is de resolutie nu zo'n vier of vijf Ångström. Maar met synchrotronstraling kunnen we echt atomair meten.'
'Röntgenkristallografie heeft enorm veel opgeleverd voor de natuurkunde, scheikunde en biologie,' zegt ook Thomas Barends, Nederlandse kristallograaf aan het Duitse Max-Planck Institute for Medical Research. 'Maar er zijn nog steeds dingen die we graag beter willen kunnen.' De wetenschappers zijn opvallend eensgezind over welke uitdagingen dat zijn. Men wil kleinere kristallen kunnen meten omdat het soms lastig is om grote kristallen te kweken van biomoleculen. Daarnaast wil men sneller kunnen meten zodat kristallen tijdens de meting niet kapot gaan door de röntgenstraling en om chemische reacties op de voet te kunnen volgen.
Vernieuwing
Bij twee grote Europese onderzoeksfaciliteiten voor röntgenstraling vinden grootscheepse vernieuwingen plaats om dat te bereiken. Bij het ESRF wordt sinds voorjaar 2010 verbouwd. Vanaf eind dit jaar hoopt men met een tweede fase van start te gaan, waardoor in 2020 de ESRF weer het beste synchrotron ter wereld moet zijn. 'Deze vernieuwingen van het synchrotron zijn een sine qua non,' zegt Gros. 'Dit gaat zeker successen opleveren en als je het niet doet dan komt de klad erin.'
Tot nu toe zijn er al elf nieuwe zogeheten bundellijnen met vijftien onafhankelijke meetstations gebouwd. De optica is vernieuwd om de fotonenbundels beter te focusseren. De tweede fase behelst het verbeteren van de zogeheten storage ring waardoor de intensiteit en coherentie van de bundel met een factor dertig toenemen. 'Men heeft uitgerekend dat dit vijf grootteordes winst kan opleveren in de hoeveelheid fotonen die op een kristalletje terecht komen', legt Dijkstra uit. 'Je kunt daardoor meten aan veel kleinere kristallen van een micrometer groot, in plaats van vijftig tot honderd micrometer.'
Volgens Piet Gros gaat het niet alleen om de vernieuwingen van de laatste jaren, maar is ESRF altijd bezig met verbeteringen onder andere van de röntgenbundels. 'We lopen voortdurend aan tegen de grenzen van wat experimenteel mogelijk is met onze eiwitten. Als gebruiker zie ik duidelijk dat er nu veel meer mogelijk is dan tien, twintig jaar geleden. Dat heeft onze successen mogelijk gemaakt bijvoorbeeld bij het ophelderen van de eiwitcomplexen van het complement systeem.'
Supersnel meten
Bij de Duitse synchrotronfaciliteit DESY in Hamburg wordt gebouwd aan een nieuwe vrije elektronenlaser van röntgenstraling, die in 2016 klaar moet zijn. Het is dan een van de slechts drie X-ray Free Electron Lasers (XFELs) ter wereld, naast de VS en Japan. De XFEL heeft als groot voordeel dat de straling die nodig is om een diffractiepatroon van een kristal te meten in een heel korte puls van enkele femtoseconden is geperst, legt Barends uit. 'Het kristal gaat dan wel kapot door stralingsschade, maar de meting gaat zo snel dat de data al binnen is voordat het kristal beschadigd raakt.'
Onderzoekers in de VS is het op deze manier gelukt om een cluster van mangaanatomen te bestuderen die in het fotosysteem II voorkomt, vertelt Barends. 'Deze clusters zijn zeer gevoelig voor stralingsschade. Als je daar kristallografie aan doet weet je al dat je resultaat niet klopt. Deze onderzoekers hebben nu laten zien dat de clusters tijdens de meting in de XFEL wel intact blijven.'
Maar één meting is niet genoeg voor het opnemen van een kristalstructuur. Je hebt er tienduizenden nodig. Omdat elk kristal kapot gaat tijdens de meting zijn grote hoeveelheden kristalletjes nodig van enkele micrometers. Die zijn volgens sommigen veel makkelijker te maken dan een mooi eenkristal van enkele tientallen micrometers. Barends twijfelt daaraan: 'Als je wat aandacht besteedt aan kristallisatie is het misschien evengoed mogelijk één groot kristal te maken als veel kleine. Maar bijvoorbeeld membraaneiwitten en liposomen zijn inderdaad heel moeilijk te kristalliseren.' Gros voegt toe dat het niet triviaal is om zoveel van die kleine kristallen te verkrijgen. 'Het zou een voordeel zijn als je met minder materiaal toe kan. Van onze eiwitten hebben we niet altijd zoveel materiaal.'
Onderzoeksplannen
Vast omlijnde ideeën voor nieuw onderzoek zijn er nog niet omdat het nog even duurt voordat de twee bouwprojecten klaar zijn. Eensgezind noemen de wetenschappers de membraaneiwitten als belangrijk onderzoeksdoel. Dijkstra verwacht bijvoorbeeld doorbraken in onderzoek naar hersenreceptoren. 'Voor het ontrafelen hoe het geheugen werkt zal het zal enorm helpen om in ieder geval het moleculaire gedeelte van die processen te begrijpen.'
Ook Barends denkt aan membraaneiwitten als belangrijk onderzoeksdoel voor de komende jaren. 'De XFEL is met name nuttig voor eiwitten die gevoelig zijn voor stralingsschade.' Zelf werkt hij aan een nieuw enzym dat een rol speelt in de stikstofcyclus. 'Wanneer ik dit eiwit met een synchrotron meet is de eerste meting heel goed. Maar in de loop van het experiment zie ik dat het kristal kapot gaat. Dit enzym is dus typisch geschikt voor analyse met de XFEL. Daarmee verwacht ik precies te kunnen zien waar alle zijketens van aminozuren zich bevinden. Daarna kunnen we gaan uitzoeken hoe het enzym eigenlijk werkt.'
Screening
De aanpak van het structuuronderzoek verandert door deze nieuwe technologieën, zegt Dijkstra. 'Het gaat veel meer lijken op high-throughput screening. Bij lasers hebben we het dan over metingen van femtoseconden, bij het synchrotron over microseconden. Je kunt met een synchrotron dus langer meten waardoor je meer informatie krijgt uit een meting dan met een vrije elektronenlaser.'
Andere voordelen van een synchrotron, zegt Dijkstra, zijn niet alleen dat de theorie en technologie al tientallen jaren bekend is, maar ook dat aan één storage ring tientallen bundellijnen tegelijk kunnen worden gekoppeld. 'Na de upgrade van het ESRF kunnen meteen dertig meetstations gebruik maken van de vernieuwde faciliteiten. Bij een vrije elektronenlaser gaat het om maximaal een handvol meetstations. Bovendien ligt het energiegebruik van een XFEL een stuk hoger dan van een synchrotron.'
Piet Gros werkt nog niet met XFEL maar is wel met DESY in gesprek om een vinger aan de pols te houden over toekomstige mogelijkheden. 'XFEL is een erg nieuwe techniek. Het is prachtig dat het kan maar er is nog veel onbekend. Er moeten nog methoden ontwikkeld worden en bovendien is een meting duur. Het is nog niet haalbaar om dit als onderdeel van een standaard analyse op te nemen. Maar in extreme gevallen is het een unieke uitkomst, bijvoorbeeld met membraaneiwitcomplexen is de kans dat je grote kristallen krijgt erg klein, dus dan wordt de noodzaak om dergelijke methodes toe te passen steeds groter.'
Data en detectie
Een probleem voor alle nieuwe röntgendiffractiefaciliteiten is nog wel de snelheid van de detectoren en computers die alle data moeten opslaan. Detectoren hebben nu een framerate van een milliseconde, maar dat moet nog sneller. Er komt dus elke milliseconde een nieuwe hoeveelheid data op de detector die wordt doorgestuurd naar de computers, dat zijn terabytes per dag. 'Zelfs met de beste computers lukt het bijna niet meer om al die data op tijd op te slaan. Is het eenmaal opgeslagen, dan is het een kwestie van off-line veel computers tegelijk laten rekenen,' zegt Dijkstra. Meer of snellere computers is niet zomaar een oplossing, denkt hij. 'Er wordt hopelijk binnenkort in Europees verband, onder andere met ESRF en DESY, een onderzoek gestart naar hoe je dit probleem het beste kunt oplossen.'
Voor XFEL ligt het nog lastiger, zegt Barends. 'Detectoren die zo snel kunnen meten zijn nog in ontwikkeling. De data die we krijgen zijn nog niet zo goed als we gewend zijn met synchrotrons. Maar dat is ook wel het leuke aan dit onderzoek: alles is nieuw. Voor mij als eiwitkristallograaf maar ook voor de natuurkundigen die versnellers en detectoren bouwen.'
Hoe werkt een synchrotron?
Röntgenstralen ofwel X-rays, zijn zeer geschikt voor het bestuderen van materialen en processen op atomaire schaal van een nanometer of zelfs minder en met een snelheid van picoseconden tot femtoseconden (10-12 tot 10-15 s). Dat komt doordat deze elektromagnetische straling een golflengte heeft in de orde van de afmeting van een atoom: van een honderdste tot tien nanometer en dus een frequentie van 1016 tot 1019 Hz. Röntgenstraling wordt opgewekt door elektronen te versnellen, en vervolgens in een ring te laten lopen. Daardoor ondervinden ze continu een versnelling door de middelpuntzoekende kracht. Geladen deeltjes die versnellen zenden straling uit in dit geval in de vorm van fotonen met de golflengte van röntgenstraling. In een fotonenbron zoals die in Grenoble (Frankrijk) en Hamburg (Duitsland) worden de elektronen eerst losgemaakt uit een halfgeleider (1), dan versneld met behulp van microgolfbronnen (2 en 3) tot bijna de lichtsnelheid in een lange tunnel en vervolgens in een ringvormige opslagbaan (4) gehouden. De fotonen die vrijkomen worden opgevangen in een van de bundellijnen (5) waarna ze gebruikt worden in een van de meetstations (6).
En een X-ray Free Electron Laser?
Wanneer je in de ring van een synchrotron wat magneten bijplaatst zodat de elektronen in een slalom gaan lopen, ondervinden ze steeds een extra versnelling waardoor er meer straling vrijkomt. De extra intensiteit is evenredig met het aantal magneten. Een XFEL is een kilometers lange rechte versneller in plaats van een ringvormige. Daarin zijn ook extra magneten geplaatst om de elektronen in een slalom te laten lopen. Het effect in dit geval is een extra versterking van de intensiteit van de röntgenstraling met het kwadraat van het aantal magneten. Bovendien gaan de elektronen met bijna de lichtsnelheid, zodat ze in de pas lopen met de fotonen die ze zelf uitstralen. Deze effecten versterken elkaar zodat er uiteindelijk pulsen van fotonen ontstaan die een miljard keer intenser zijn dan gewone röntgenbronnen en extreem kort, namelijk enkele femtoseconden.
Wat is SFX?
Serial Femtosecond X-ray crystallography is een naam voor de meettechniek waarbij een stroom van kleine kristallen in een suspensie in de röntgenbundel wordt geschoten. Elk kristal wordt maar een keer belicht en is daarna kapot. Er worden dus veel kristallen in serie gemeten. De afkorting SFX is ook gekozen omdat die in het Engels klinkt als 'special effects'.
Dit artikel is gepubliceerd in C2W12
