Microscopische technieken zoals atoomkrachtmicroscopie (AFM) zijn in staat om plaatjes te produceren waarop je de atomen kunt tellen. Zo´n plaatje geeft echter geen informatie over de chemische samenstelling. Daar is een analyse met bijvoorbeeld UV-, VIS-, nabij-IR of Raman-spectroscopie voor nodig. Maar spectroscopie is altijd gebonden aan de zogeheten diffractielimiet. De resolutie van zo'n meting kan daardoor nooit beter zijn dan de helft van de gebruikte golflengte. Voor spectroscopie in het zichtbare gebied is dat dus maximaal zo'n 300 nanometer.
Tip-enhanced Raman spectroscopy
Een slimme keus is het combineren van deze twee technieken, legt Hiroshi Uji-i uit. Hij is hoogleraar aan de KU Leuven en gespecialiseerd in hoge-resolutiemicroscopie. Dat is voor het eerst rond de milleniumwisseling gedaan met AFM-microscopie en Ramanspectroscopie. Het signaal van zogeheten Ramanscattering is heel zwak. De AFM-tip versterkt dat signaal. “Als je een AFM-tip die gecoat is met een edelmetaal, beschijnt met een laser vormt zich een zogeheten gelokaliseerd oppervlakteplasmon. Dat is een collectieve trilling van vrije elektronen op een metalen oppervlak. Dit plasmon zorgt voor een Ramansignaal van het monster, maar enkel rond de tip dus op een stukje monster van zo´n 10 tot 20 nm groot”, legt Uji-i uit. Deze nieuwe techniek werd TERS gedoopt: tip-enhanced Raman spectroscopy.
Al eerder was aangetoond dat het Ramansignaal flink versterkt kan worden door het monster op een goud- of zilveroppervlak te adsorberen. Deze methode wordt surface enhanced Raman spectroscopy genoemt (SERS) en is al in de jaren zeventig ontwikkeld. Een nadeel van SERS is dat je weliswaar beter het oppervlak van een monster kunt meten (in plaats van de bulk), maar je bent nog steeds gebonden aan de diffractielimiet. Door een gemetalliseerde AFM-tip te gebruiken als versterker omzeil je de fysieke barrière en kan TERS een resolutie van 10 nm bereiken.
Het oppervlak belicht
Corianne van den Akker onderzocht aan het AMOLF met behulp van TERS de eiwitten die bij diabetespatiënten de celmembranen kapot maken. De peptidenvolgorde van deze amyloïden is bekend en de structuur van het eiwit, dat fibrillen vormt, is met infraroodspectroscopie gemeten. "Maar die techniek levert de bulkstructuur. IR en Ramanspectroscopie meten het gemiddelde van het hele monster. De samenstelling van het oppervlak was nog onbekend, maar wel belangrijk want juist het oppervlak gaat interacties aan met het celmembraan”, legt Van den Akker uit. Andere analysemethoden zoals kristallografie of NMR faalden: amyloïden lossen niet op en kristalliseren niet.
"Ik gebruikte AFM en Ramanspectroscopie al apart van elkaar om amyloïden te bestuderen”, vertelt Van den Akker. “Het was dus een logische keus om TERS te gaan gebruiken." Zij en collega's ontdekten dat de buitenkant van de amyloïden veel minder geordend is dan de kern. Ook onderzochten ze twee verschillende typen fibrillen: stijve lange en korte kronkelige. "Met IR of Ramanspectroscopie alleen zie je de verschillen tussen die twee niet. Met TERS wel."
De metingen werden uitgevoerd door onderzoekers van het Duitse Leibniz-Institut für Photonische Technologien in Jena waar veel ervaring is met TERS-metingen aan eiwitten. Het zijn namelijk geen eenvoudige metingen, zegt Van den Akker: "Het is lastig voorspelbaar of je een goede meting krijgt of niet. Dat kan aan de kwaliteit van de AFM-tip met zilvercoating liggen, of hoe schoon je monster is. Naderhand moet je een paar honderd spectra met de hand analyseren. Dat proces moet nog geautomatiseerd worden."
Betere tips
"Op dit moment is het maken van de tips het grootste probleem van TERS”, beaamt Uji-i. “Je kunt slechts één op de tien tips gebruiken, zo slecht reproduceerbaar zijn ze. Bovendien zijn de tips gevoelig voor oxidatie.”
Uji-i werkt met Steven De Feyter op de KU Leuven voornamelijk aan het verbeteren van de AFM-tips. Onlangs publiceerde hij een methode om tips te maken met nanodraad van zilver in plaats van door middel van vacuümdepositie of elektrochemisch etsen van een AFM-tip. “Het zilver is monokristallijn in plaats van polykristallijn en de vorm van de tips is veel beter reproduceerbaar. Ook zijn ze gecoat met een surfactant waardoor ze veel minder last hebben van oxidatie. Van de tien tips die wij op deze manier maakten, konden we er ook tien gebruiken”, aldus Uji-i. "In de toekomst willen we tips van hoge kwaliteit voor TERS-metingen op de markt brengen, samen met het Nederlandse bedrijf AIST-NT."
"Als er geen manier komt om de tips reproduceerbaar te maken, houdt het snel op voor TERS”, zegt Uji-i. “Maar zodra dat probleem is opgelost, denk ik dat DNA-mapping de belangrijkste mijlpaal wordt in de toekomst." Daarbij is het letterlijk de bedoeling een kaart te maken van het DNA waarop alle genen en de afstanden daartussen zijn vastgelegd. Er zijn al TERS-metingen gedaan aan DNA en RNA waarbij met Raman de nucleobasen onderscheiden konden worden.
Katalyse in actie
Rogier Brand, promovendus in de groep van Bert Weckhuysen aan de Universiteit Utrecht, omzeilt het probleem van de tipfabricage. Hij koos voor zijn onderzoek een simpeler versie van TERS: een gewone AFM gekoppeld aan een Ramanspectrometer. De tips van de AFM hoeven in dit geval niet gecoat te zijn. "Met deze opstelling kan ik een plaatje maken van het monster met de AFM en op zo'n 50 nanometer nauwkeurig de plaats bepalen waar we een Ramanspectrum willen opnemen. Nog een voordeel is dat wij geen doorzichtig monster hoeven te maken. Dat is vaak voor TERS wel nodig omdat daarbij de laser van onderaf door het monster heen schijnt. Wij gebruiken een AFM-laserstraal die vanaf de bovenkant schuin op het monster straalt. Nadeel is wel dat wij nog gebonden zijn aan de diffractielimiet. De resolutie van AFM-Raman is ongeveer 250 nm”, aldus de onderzoeker.
Maar de eisen aan het monster zijn voor Brand belangrijker dan de resolutie. Hij onderzoekt katalytische oppervlakken, die doorgaans niet doorzichtig zijn. Hij gebruikt metal organic frameworks (MOFs) die hij laagje voor laagje op een met zilver gecoat glasplaatje zet waarop thiolen zitten met carbonaatgroepen aan het uiteinde. Daaraan bindt de eerste MOF-laag die hij met AFM-Raman kan bestuderen. Dan volgt een volgende laag. "Door de opbouw van de MOFs laag voor laag te bekijken, kan ik afleiden hoe een MOF opbouwt. Gebeurt dat door kristallisatie op één punt bijvoorbeeld door een foutje in het rooster? Of gaat het laag voor laag? Dat is fundamentele kennis die nodig is voor het beter kunnen bouwen van katalysatoren zoals MOFs en zeolieten."
Eerder liet een Utrechtse collega van Brand samen met Duitse TERS-specialisten al zien dat het mogelijk is om een katalytische reactie met TERS te volgen. De met zilver gecoate tip was daarbij zowel katalysator als leverancier van het versterkte Ramansignaal. Hierbij ging het om een modelreactie, de reductie van p-nitrofenol. Brand wil met zijn onderzoek toewerken naar meer realistische katalytische systemen onder reactiecondities. Daarvoor bouwt hij aan een nieuwe opstelling waarin hij AFM kan meten tijdens de synthese van de MOFs, dus in situ. De reactie verloopt in een drukvat bij 150°C en 20 bar. "Uiteindelijk wil ik hiermee heterogene katalytische reacties bestuderen met AFM in combinatie met spectroscopie, zoals fluorescentie, IR als Raman."
TECHNIEKEN OP EEN RIJTJE
Bij AFM (Atomic Force Microscopy ofwel atoomkrachtmicroscopie) scant een heel dunne naald van bijvoorbeeld siliciumnitride over het oppervlak van een monster, als een platenspeler. Aan de naald zit een veer bevestigd. Door het doorbuigen van die veer met een laser te meten, kun je de kracht tussen de tip en het oppervlak aflezen en daarmee een plaatje van het oppervlak construeren.
Raman-spectroscopie geeft, net als IR-spectroscopie, een signaal waarmee de energieniveau's van vibraties en rotaties in een molecuul worden gemeten. Dat levert een vingerafdruk van het molecuul. Raman-spectroscopie meet de Raman-verstrooiing van één golflengte (laser)licht.
Bij TERS (tip-enhanced Raman spectroscopy) scant de AFM-tip over het oppervlak en tegelijkertijd wordt van onderaf het monster bestraald met een Raman-laser. De speciale AFM-tip is gecoat met zilver zodat zich zogeheten oppervlakteplasmonen vormen op de plek waar de AFM-tip het monster aftast. Plasmonen zijn elektronen die genoeg energie hebben om Raman-excitatie te bewerkstelligen en zodoende het Raman-signaal ter plaatse flink te versterken. De plek waar de plasmonen loskomen aan de tip is klein, zo'n 10 nm. Het gebied waar je het Raman-spectrum meet is dus even klein waardoor de resolutie van de meting veel beter is dan normaal.
ANDERE COMBINATIES
De combinatie van AFM met Raman-spectroscopie is wel de meest gebruikte, maar niet de enige combinatie van microscopie met spectroscopie. Onderzoekers van het Oak Ridge National Laboratory in de VS ontwikkelden samen met het bedrijf Anasys een methode om met een AFM-tip materiaal van het gescande oppervlak af te schieten en naar een massaspectrometer te leiden voor chemische analyse.
Hetzelfde bedrijf, Anasys, ontwikkelde ook een combinatie van AFM-IR. Die techniek maakt gebruik van het feit dat een materiaal dat met een infraroodlaser wordt beschenen heel kort uitzet door de hitte die ontstaat. Daardoor gaat de AFM-naald trillen. De frequentie van die trilling is evenredig met de IR-absorptiecoëfficiënt van het materiaal zodat daaruit het IR-spectrum exact op de plek van de AFM-naald kan worden afgeleid.
Ook fluorescentiespectroscopie kan gecombineerd worden met AFM. Hiroshi Uji-i van de Universiteit Leuven gebruikt deze techniek om de interactie tussen eiwitten en DNA te bestuderen, bijvoorbeeld de binding van een HIV-gerelateerd eiwit aan DNA.
Dit artikel is gepubliceerd in C2W nr. 16, september 2015.
